Окислительный стресс (оксидативный стресс) – процесс повреждения клетки в результате окисления, с последующим распространением повреждения во внеклеточную среду. Изучение данного вопроса началось с середины 50х годов прошлого века, когда основным маркёром свободно-радикальных процессов служили продукты перекисного окисления липидов [4]. Под действием оксидативного стресса, так же меняется нативная конформация белковых молекул, вплоть до фрагментации, что отражается на их функции. Окислительная модификация белков (ОМБ) – одно из основных последствий протекания свободно-радикального окисления в живых системах, опосредованное воздействием активных форм кислорода и реактивных форм азота [1].
В результате свободно-радикальных процессов могут образоваться активные формы кислорода (АФК) и активные формы азота. Эти процессы стимулируют экзогенные факторы, такие как фотохимический смог, озон, пестициды, ксенобиотики, ультрафиолетовое излучение, х– и γ–лучи (рис. 1). Кроме этого существенный вклад вносят эндогенные факторы: продукты метаболизма митохондрий, продукты микросомальных реакций, катализируемых цитохромом P450, реакции катализируемые металлами, продукты метаболизма аргинина, продукция нейтрофилами и макрофагами, при воспалении АФК, ведущие к ОМБ [5]. В человеческом организме наиболее распространены реакции Фентона и Габера-Вейса, генерирующие гидроксил-радикалы [8].
Рис. 1. Инициация свободно-радикальных процессов
В настоящее время роль мужского фактора в развитии бесплодия существенно занижена. В России зафиксировано от 10 % до 17 % бесплодных супружеских пар (4-4,5 млн.) [3, 7]. Из рекомендаций ВОЗ к качеству эякулята следует, что за последние 30-40 лет требования к некоторым показателям спермограммы снизились на 25-35 % [6]. Это заставляет задуматься о поиске причин и механизмов повреждения сперматозоидов. Одним из таких механизмов, вероятно, может являться воздействие АФК или реактивных соединений азота на биополимерные составляющие сперматозоидов, такие как нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и на липиды. Считается, что наиболее массивному повреждению подвергаются белковые молекулы, которые под воздействием свободных радикалов фрагментируются, с образованием карбонильных производных или же формируются внутримолекулярные сшивки, что влечёт за собой нарушения конформационной модели и сказывается на функции белков.
Цель исследования – опробовать методику определения ОМБ на сыворотке крови от доровых доноров и в спермоплазме от субфертильных доноров, оценив при этом уровень карбонильного стресса.
Материалы и методы исследования
Проведено лабораторное исследование образцов эякулята 92 мужчин, состоящих в бесплодном браке, средний возраст которых составил 37,7 ± 0,7 года. Взятие материала проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ (2010). Исследована сыворотка периферической крови 10 практически здоровых доноров. Для оценки ОМБ использовали следующую методику [2]. Реакцию проводили с 0,1M раствором 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ). В контрольной пробе использовали растворитель ДНФГ. Известно, что для алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов (аДНФо) нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован при 260 нм, основного характера – 530 нм (аДНФн). Для алифатических кетон-ДНФ нейтрального характера спектр поглощения составляет 365 нм (кДНФн), основного характера – 430 нм (кДНФо). Содержание карбонилов вычисляли из пика поглощения при соответствующих длинах волн. Концентрацию окисленных белков выражали в нмоль/мг общего белка. Общий белок в спермальной жидкости определяли с помощью биуретовой реакции (Вектор-Бест, Новосибирск).
Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и t-критерия Стьюдента для парных данных.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследований установлено, что уровень кДНФн сыворотки крови здоровых доноров составил 1,24 ± 0,15 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,56 ± 0,12 нмоль/мг белка), что соответствует результатам, полученным как в классическом варианте реакции (p gt;0,05) [9], так и литературным данным [10]. Уровень кДНФо составляет 0,74 ± 0,11 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,36 ± 0,07 нмоль/мг белка), а аДНФн – 0,37 ± 0,07 нмоль/мг белка (контрольная проба 0,25 ± 0,05 нмоль/мг белка). Таким образом, суммарная концентрация окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров составляет 2,35 ± 0,11 нмоль/мг белка (рис. 2). Выявлено, что на долю аДНФн приходится 16 %, на долю кДНФо – 31,5 %, на долю кДНФн – 52,5 % окисленных белков. Соотношение окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров кДНФн: кДНФо: аДНФн составляет 1: 2: 3,3. По техническим причинам измерение аДНФо сыворотки крови не производилось на данном этапе исследований.
Установлено, что концентрация карбонилов в спермоплазме составила 2,01 ± 0,10 для аДНФо, 0,80 ± 0,04 – кДНФн, 0,43 ± 0,02 – кДНФо и 0,23 ± 0,01 нмоль/мг белка для аДНФн. Следовательно, суммарная концентрация окисленных белков составляет 3,47 ± 0,4 нмоль/мг белка (рис. 2). Соответственно на долю аДНФн приходится 6,5 %, на долю кДНФо – 12,5 %, на долю кДНФн – 23 % и на долю аДНФо 58 % окисленных белков. Соотношение окисленных белков спермоплазмы субфертильных доноров аДНФн: кДНФо: кДНФн: аДНФо составляет 1: 1,9: 3,5: 8,7.
Рис. 2. Спектр окисленных белков сыворотки крови и спермоплазмы
Выводы
1. Предложенный метод оценки ОМБ пригоден для оценки карбонильного стресса эякулята.
2. Показатели карбонильного стресса эякулята ниже, чем показатели сыворотки крови, что говорит о более активной работе антиоксидантов в данной биологической жидкости.
3. При оценке уровня карбонильного стресса следует использовать параметры относительного содержания производных ОМБ и параметры соотношения фракций относительно друг друга.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта «р_а 16-44-590429».
Библиографическая ссылка
Вавилов Н.В. ПАРАМЕТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА, ОТРАЖАЮЩИЕ УРОВЕНЬ КАРБОНИЛЬНОГО СТРЕССА // Международный студенческий научный вестник. – 2017. – № 4-6. ;URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=17557 (дата обращения: 19.04.2024).