Пробиотические штаммы продолжают использоваться в практической медицине для коррекции дисбиоза различных биотопов макроорганизма. Различные виды лактобактерий, в частности представители рода Lactobacillus семейства Lactobacillaceae, являются основой пробиотических препаратов. Их антагонистическая активность обусловлена образованием органических кислот, перекиси водорода, бактериоцинов и др. соединений [1, 6, 9]. Ее наличие установлено в отношении различных видов микроорганизмов, включая грамотрицательные и грамположительные бактерии, а также грибы (фунгицидная активность присуща гидроксипроизводным жирных кислот, бензойной кислоте, циклическим дипептидам и другим веществам, продуцируемым лактобациллами) [1, 6, 10].
Среди последних грибы рода Candida являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, ротовой полости и нижних отделов мочеполовой системы, становясь причиной воспалительных поражений слизистых, а в ряде случаев, и системных инфекций. Однако вопрос об антагонистической активности лактобацилл в отношении грибов рода Candida имеет противоречивые ответы, что, очевидно, связано с продолжающимся изучением взаимодействия между этими микроорганизмами. Одни авторы установили ее наличие, другие – нет [6, 7]. К тому же при ее изучении используются различные методы.
Поэтому целью данного исследования явилось определение антагонистической активности пробиотических штаммов лактобактерий в отношении клинических штаммов кандид с использованием разных методов, для осуществления которой предстояло решить следующие задачи – выделить чистые культуры штаммов грибов, пробиотических штаммов лактобацилл и реализовать выбранные методы: 1) совместное культивирование на твердой питательной среде; 2) совместное инкубирование в стерильном физиологическом растворе и, для сравнения, в жидкой питательной среде.
Для реализации первого метода в работе использован лиофилизат синбиотического препарата «Максилак бэби» НПО «Микроген», Россия, 6 клинических штамма грибов Candida albicans, выделенных из носоглотки и полости рта новорожденных детей, для реализации второго - 1 штамм лактобацилл (Lactobacillus fermentum), выделенный из препарата «Лактобактерин» НПО «Микроген», Россия, 4 клинических штамма грибов Candida albicans, выделенных из влагалищного отделяемого беременных женщин.
Совместное культивирование опытных штаммов на твердой питательной среде осуществляли по собственной опытным путем подобранной методике, создающей условия как из метода двухслойного агара благодаря возможности растущим культурам контактировать с метаболитами друг друга, так и метода посева штрихами, при котором культуры находятся на достаточно близком друг от друга расстоянии. На основе препарата «Максилак бэби» готовили суспензию в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. С той целью к 0,1г взвешенного в стерильной посуде лиофилизата добавляли 9,9мл стерильного физиологического раствора, через 15 минут тщательно перемешивали стерильной палочкой и раскапывали по 0,5мл в стерильные чашки Петри диаметром 95мм. Затем в каждую чашку добавляли по 20 мл расплавленного теплого стерильного лактоагара и перемешивали с суспензией вращательными движениями на плоскости.
После застывания агара на его поверхность мерной петлей (10мкл) наносили приготовленную на стерильном физиологическом растворе суспензию 48-часовой культуру кандид (105 КОЕ/мл), предварительно субкультивированных на лактоагаре, и распределяли прокаленным и остуженным шпателем. В качестве контроля использовали посевы кандид на лактоагаре при отсутствии пробиотических штаммов, а также посев синбиотического препарата в лактоагар без кандид.
Посевы инкубировали в аэробной атмосфере при температуре 37°C в течение 48 часов, затем подсчитывали количество выросших на поверхности агара колоний дрожжеподобных грибов при наличии роста пробиотических штаммов в толще питательной среды.
Метод совместного инкубирования штаммов предполагает смешивание в пробирке одинаковых объемов суспензий суточных культур концентрацией 109 КОЕ/мл и инкубирование в течение суток с последующим мерным высевом на твердые среды для подсчета выросших колоний [8,10]. Культуру лактобацилл выделяли мерным посевом десятикратного разведения пробиотического препарата (10-4-10-5) в лактоагар в чашках Петри [2]. Предварительное культивирование штаммов (трехкратные пересевы двухсуточных культур) осуществляли в столбиках лактоагара в аэробных условиях при температуре 37°C. Дополнительно нами использовано инкубирование штаммов в жидкой питательной среде (в сахарном бульоне). Из двухсуточных культур тест-штаммов готовили суспензии указанной концентрации по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, смешивали по 2мл каждой в пробирке и через 24 часа инкубации при 37°С в аэробной атмосфере делали трехкратный мерный высев (10 мкл) на лактоагар в чашках Петри. Через 48 часов подсчитывали количество выросших колоний грибов и лактобактерий, для дополнительной дифференцировки выросших культур готовили мазки, окрашенные по методу Грама. В качестве контролей использовали суспензии лактобактерий и суспензии грибов в чистой культуре. Для совместного инкубирования штаммов в жидкой питательной среде по 10 мкл приготовленной суспензии засевали в 2 мл сахарного бульона для инкубирования в чистой культуре и 4 мл среды для совместного инкубирования.
Антагонистическая активность оценивалась как слабая в случае уменьшения количества колоний грибов по сравнению с контролем на 0,6-3,2 lg, как умеренная – на 3,4-5,8 lg и высокая – на 5,9-6,5 lg [9].
Результаты.
При совместном культивировании штаммов на твердой питательной среде на всех чашках с лактоагаром отмечался видимый рост пробиотических штаммов в виде газона внутри пласта среды без выхода на поверхность. Количество колоний грибов в контрольных посевах соответствовало 103 КОЕ. В условиях совместного культивирования только у одного штамма кандид количество выросших колоний не отличалось от контроля, у остальных штаммов оно оказалось ниже: на один порядок у одного и на 2 порядка у четырех, что соответствует слабой антагонистической активности.
При совместном инкубировании в физиологическом растворе антагонистическая активность лактобактерий проявилась только в отношении 1 штамма гриба (количество клеток было снижено по сравнению с контролем на 0,6 lg), аналогичные данные были получены при совместном культивировании в сахарном бульоне. Также отмечено преобладание количества колоний остальных штаммов грибов над количеством лактобактерий в обоих условиях культивирования на 2 – 3 lg.
Заключение.
Таким образом, синбиотические штаммы лактобацилл по результатам используемого нами метода совместного культивирования на твердой питательной среде обладают слабой антагонистической активностью в отношении опытных штаммов кандид. Это может быть обусловлено и комплексным посевом синбиотика без выделения чистых культур его лактобацилл. Следует отметить, что данный подход уже осуществлялся нами путем посева десятикратных разведений синбиотического препарата в слой лактоагара с последующей инкубацией в аэробных условиях и пересевом отдельных выросших колоний в МРС-бульон в стерильные центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками и столбики лактоагара для получения биомассы для приготовления суспензии инокулюма чистой культуры. Но, в отличие от лиофилизата, она не дает газонного роста культуры и, поэтому, заметной антагонистической активности.
Отсутствие антагонистической активности чистой культуры лактобактерий в отношении 3х штаммов грибов при совместном инкубировании как физиологическом растворе, так и в сахарном бульоне может быть обусловлена их устойчивостью к метаболитам лактобацилл, которые могут синтезироваться в питательной среде размножающейся популяцией или вовсе отсутствовать при данных условиях инкубирования. Следует отметить, что у беременных при нормоценозе и кандидозном поражении влагалища, согласно данным литературы, L.fermentum выделяется, но не относится к доминирующим видам данного биотопа (Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri), в случае кандидозного вагинита, однако L.fermentum занимает 4 место по частоте выделяемости [5]. Поэтому для них может быть не характерна активная выработка фунгицидных метаболитов.
Главным же представляется тот факт, что в литературе имеются сведения о различных типах взаимодействия в смешанных бульонных культурах между представителями рода Lactobacillus и грибами рода Candida, изучаемых в настоящее время и не обязательно носящих антагонистический характер [3,4]. Наличие антагонистической активности лактобацилл при инкубировании в жидкой среде только в отношении одного штамма кандид обусловлено, очевидно механизмами кворум-сенсинга, которые функционируют у сочетаний одних и тех же таксономических групп по-разному и, зависят, от конкретного штамма [3,4].
Отсутствие антагонистической активности лактобактерий в отношении трех штаммов грибов при использовании второго метода – совместного инкубирования в жидкой фазе еще и с количественным преобладанием кандид может быть обусловлено накапливаемыми в настоящее время данными о необходимости пересмотра концепции однонаправленного влияния штаммов одного вида микроорганизмов на другой вид (например, антагонизм лактобацилл – потенциальных «штаммов-ингибиторов» в отношении кандид – ожидаемых штаммов-мишеней) в концепцию взаимовлияния разных видов друг на друга.
Библиографическая ссылка
Кряквина Е.В., Неборская Ю.А., Мартиросян Е.А., Фатуллаева Г.А., Шаповал О.Г. АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ В ОТНОШЕНИИ ГРИБОВ ВИДА CANDIDA ALBICANS В УСЛОВИЯХ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ // Международный студенческий научный вестник. – 2018. – № 6. ;URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=19434 (дата обращения: 20.04.2024).