Введение. В условиях воздействия различных видов стресса (тяжелая физическая нагрузка, переохлаждение, перегревание, химический, эмоциональный стресс и др.) в организме человека и животных развиваются нарушения, которые характеризуются активацией перекисного окисления липидов и рассогласованием системы антиоксидантной защиты, а также изменениями липидного и углеводного обмена [1]. Кроме того, истощение резерва адаптации сопровождается формированием оксидативного стресса.

Одними из средств, которые оказывают антирадикальное и антиоксидантное действие, являются природные растительные полифенольные соединения, что определяет возможность фармакологической профилактики стресса [2]. Природные ресурсы Российской Федерации предполагают широкое использование самовозобновляемой сырьевой базы в виде ягодного сырья для создания разнообразных антистрессорных фитопрепататов [3]. Виноград Амурский является богатым источником природных антиоксидантов [4]. Преобладающим видом биологически активных веществ винограда являются комплексы олигомерных проантоцианидинов (КОПЦ), которые представляют собой полимерные формы флавоноидов из группы катехинов. Учитывая особенности химического строения, КОПЦ могут быть самостоятельной окислительно-восстановительной системой (хинон-семихинон-фенол), которая оказывает влияние на процессы транспорта протонов и электронов в реакциях окисления [5]. Виноградные косточки являются массовыми отходами при переработке винограда, особенно в винодельческой промышленности. Известно, что проантоцианидины косточек винограда способны тормозить трансформацию ДНК и рост раковых клеток [6], регулировать уровни холестерина, триацилглицеринов и липопротеинов высокой и низкой плотности [7].

В настоящей работе был использован водно-спиртовый (40%) экстракт из косточек винограда Амурского (Vitis Amurensis), в состав которого входит до 65% фенольных соединений (флавонолы, лейкоантоцианы, катехины и их полимерные формы, проантоцианидины, олигомерные таннины, лигнин, и др.). Препаратом сравнения явился известный стресс-протектор - аптечный «Экстракт элеутерококка».

Цель данного исследования - изучение массовых индексов внутренних органов животных и показателей липидного состава плазмы крови крыс при остром стрессе и их коррекция экстрактом из косточек винограда Амурского.

Материалы и методы исследования. Косточки винограда экстрагировали 40% этиловым спиртом методом реперколяции. В эксперименте использовали крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Острый стресс воспроизводили путем вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку на 24 часа [8]. Спиртовые экстракты из косточек винограда (ЭКВ) и элеутерококка освобождали от спирта путем упаривания в вакууме. В водном растворе упаренных экстрактов определяли концентрацию общих полифенолов и вводили животным в количестве 100 мг полифенолов/кг массы тела [9]. Экстракты вводили животным перорально через зонд 2 раза в течение эксперимента (до вертикальной фиксации и через 4 часа после). Животные были разделены на четыре группы по 10 крыс в каждой: 1-я – контроль (интактные животные), 2-я – стресс, 3-я – стресс+экстракт из косточек винограда, 4-я – стресс+экстракт элеутерококка. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Кровь брали из шейной зоны в вакуумные пробирки с зеленой крышкой «Vakuette». Далее измеряли массу надпочечников, селезенки и количество изъязвлений на слизистой желудка. Содержание общего холестерина, общих фосфолипидов, триацилглицеринов и липопротеинов в плазме крови определяли с помощью диагностических наборов «Ольвекс диагностикум» (Россия). Уровень малонового диальдегида (МДА) в крови определяли по методу Buege and Aust [10].

Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследований. После вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку в течение 24 часов весовые коэффициенты внутренних органов характеризовались следующими значениями: увеличением массы надпочечников на 53% (9,00±0,30 мг/100 г массы по сравнению с 5,88±0,27 мг/100 г массы в контроле, p<0,01), снижением массы селезенки на 36% (250±24 мг/100 г массы по сравнению с 393±35 мг/100 г массы в контроле p<0,01), появлением язвенных поражений слизистой оболочки желудка (2,7±0,1 шт/животное, в контроле - 0), что является известными атрибутами стресса.

В сыворотке крови под действием стресса отмечалось увеличение уровня общих липидов на 30% (р<0,001) и общего холестерина на 51% (р<0,01), тогда как количество общих фосфолипидов было снижено на 15% (р<0,001) (Таблица). В результате отношение холестерин/фосфолипиды увеличилось на 78% (р<0,001). Следует отметить рост уровня триацилглицеринов в 2,4 раза (р<0,001) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) на 40% (р<0,01) по сравнению с контрольными значениями при одновременном снижении липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) на 43% (р<0,001).

Таблица

Влияние экстракта из косточек винограда и элеутерококка на биохимические показатели плазмы крови при воздействии стресса (M±m)

Примечание: Условные обозначения: ЭКВ – экстракт из косточек винограда, МДА – малоновый диальдегид, ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПВП – липопротеины высокой плотности. Различия статистически значимы при сравнении: цифры - с группой контроля, буквы – с группой «стресс»: 1,а-р<0,05; 2,б- р<0,01; 3,в- р<0,001.

Значение показателя перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) в крови крыс группы «стресс» увеличилось на 35% (р<0,001). На основании вышеизложенного следует, что влияние стресса сопровождается выраженной картиной дислипидемии и активацией перекисного окисления липидов. Известно, что при стрессе происходит выброс в кровь катехоламинов, которые инактивируются в системе цитохрома Р-450. В данном процессе образуются активные формы кислорода (синглетный кислород, супероксидный анион-радикал и др.), что активирует свободно-радикальное окисление. При этом система антиоксидантной защиты истощается и формируется оксидативный стресс.

Введение экстрактов из косточек винограда и элеутерокока в период стрессового воздействия характеризовались тенденцией к восстановлению нарушенных стрессом весовых характеристик органов крыс и биохимических показателей крови. Однако степень выраженности нормализующего эффекта различалась в зависимости от введенного экстракта. Так, при введении экстракта из косточек винограда (3 группа) и препарата сравнения экстракта элеутерококка (4 группа) при стрессе отмечались статистически достоверные различия изученных показателей по сравнению с таковыми величинами во 2-й группе (стресс). Индекс массы селезенки в 3-й группе вырос на 55% (388±29 мг/100 г массы, р<0.01), а в 4-й группе - на 14% (340±26 мг/100 г массы, р<0.05). Индекс массы надпочечников снизился в 3-й группе на 33% (6,00±0,24 мг/100 г массы, р<0,001), а в 4-й группе - на 26% (6,64±0,26 мг/100 г массы, р<0,001). Язвенных поражений слизистой желудка не было выявлено. Значение общих липидов в плазме крови крыс при введении экстракта из косточек винограда снизилось на 22% (р<0,001), а при введении элеутерококка – на 14% (р<0,01). При этом количество общих фосфолипидов возросло на 17% (р<0,001) (3 группа) и 8% (р<0,05) (4 группа), а уровень холестерина снизился на 26% (р<0,001) и 16% (р<0,001), соответственно. В результате отношение холестерин/фосфолипиды при введении экстракта из косточек винограда снизилось на 37% (р<0,001), а при введении элеутерококка– на 13% (р<0,001). Величина ЛПНП в плазме крови крыс при введении экстракта из косточек винограда снизилась на 29% (р<0.01), а при введении элеутерококка – на 21% (р<0,05). Одновременно увеличилось значение ЛПВП в 3-й группе на 71% (р<0,001), а в 4-й группе – на 39% (р<0,001). Уровень МДА в плазме крови крыс 3-й группы снизился на 22% (р<0,001), а в 4-й группе – на 17% (р<0,05). Таким образом, введение обоих экстрактов имело выраженную тенденцию к снятию состояния дислипидемии и перекисного окисления липидов. Следует обратить внимание на тот факт, что при введении экстракта элеутерококка при стрессе сохранились статистически достоверные различия с контролем. Так, значение общих липидов превышало контроль на 12% (р<0,05), холестерина – на 26% (р<0,001), отношение холестерин/фосфолипиды – на 37% (р<0,001) при одновременно сниженном уровне ЛПВП на 20% (р<0,05). На основании вышеизложенного следует, что экстракт из косточек винограда был более эффективным стресс-протектором, чем экстракт элеутерококка.

Выводы:

1. Применение экстракта из косточек винограда Амурского при стресс-воздействии сопровождалось выраженным стресс-протекторным эффектом, который проявлялся в восстановлении массы надпочечников и селезенки, отсутствии язв на слизистой желудка и снятии дислипидемии.

2. Механизм стресс-протекторного действия комплекса биологически активных веществ экстракта из косточек винограда Амурского и экстракта элеутерококка обусловлен тем фактом, что растительные полифенолы, входящие в их состав, имеют способность улавливать свободные оксигенные и пероксильные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал, который сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса.

3. По исследованным показателям экстракт из косточек винограда Амурского показывает более высокую биологическую активность, чем таковая у препарата сравнения «Экстракт элеутерококка».

4. Косточки винограда Амурского являются перспективным видом сырья для получения стресс-протекторных препаратов.